1.      樣品組分復(fù)雜，K值分布寬

2.      大分子樣品，尤其是生物樣品，如多肽的分離

3.      樣品中含有晚流出干擾物，它們會污染色譜柱或在后續(xù)的運(yùn)行中流出

梯度洗脫方法的影響因素比較多，所以當(dāng)采用一種標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行梯度試驗(yàn)的時候，會因?yàn)槭褂玫南到y(tǒng)的不同或色譜柱的不同，而使得目標(biāo)峰的保留時間和分離效果有很大的差異

藥典方法，作為一種法定的方法，流動相的組成不能隨意變動。此時，實(shí)驗(yàn)者可以調(diào)整的只有色譜柱的品牌和梯度比例或速率。一部分實(shí)驗(yàn)者并不十分重視的色譜柱選擇，對于梯度方法是更為重要的。即使同樣的鍵合相，但生產(chǎn)廠家的不同或品牌的不同，其孔徑、比表面積等填料參數(shù)均有很大差異，對樣品的選擇性也會有很大的差異。從經(jīng)驗(yàn)來說，選擇一只合適的色譜柱會更節(jié)約實(shí)驗(yàn)中的人力和物力的消耗。您可以根據(jù)分離需要，咨詢色譜柱廠家，以獲得更專業(yè)的色譜柱推薦。確定色譜柱之后，如果需要對分離度進(jìn)行調(diào)整，首先應(yīng)該從保留時間較短的一對色譜峰的分離度開始調(diào)整，然后一對一對依次進(jìn)行調(diào)整。梯度方法和等度方法改善樣品分離度的方法和思路是一致的。

1． 基線漂移

當(dāng)采用梯度洗脫時，流動相的純度不夠易導(dǎo)致基線明顯漂移。

2.  干擾峰

當(dāng)進(jìn)行空白梯度試驗(yàn)時，尤其用短波長UV檢測和高靈敏度設(shè)置時，色譜圖中可能會出現(xiàn)很大的譜峰。這類干擾峰可能由流動相中含有的疏水性的并具有UV吸收的雜質(zhì)引起，如水、有機(jī)溶劑或流動相添加劑。出現(xiàn)這樣的狀況可通過簡單的實(shí)驗(yàn)查出污染源。

查找污染源的*步是先用水相平衡柱30min，然后進(jìn)行一次空白梯度。然后平衡5min后重復(fù)空白梯度。如*次運(yùn)行的干擾峰大得多，可能是水污染。如兩次空白運(yùn)行無差異，有機(jī)溶劑的問題可能較大。流動相添加劑的可能污染可通過重復(fù)不哈添加劑的空白梯度來檢測。當(dāng)鑒別出流動相溶劑或組分被污染后，必須用干凈的試劑代替原試劑。

另外，如果梯度條件設(shè)置錯誤也容易導(dǎo)致干擾峰的出現(xiàn)。如線性梯度被設(shè)置為臺階梯度

4.      色譜峰保留不重復(fù)

由于實(shí)際樣品可能含有的強(qiáng)保留的雜質(zhì)。如果梯度的zui終流動相組成僅為洗脫目標(biāo)組分，則強(qiáng)保留的雜質(zhì)可能會在色譜柱上發(fā)生聚集，因而會改變柱效和保留值。所以建議在梯度洗脫末尾時，保持強(qiáng)洗脫溶劑一段時間，以便清洗色譜柱，保證更好的重復(fù)性。

梯度洗脫中，在一次進(jìn)樣結(jié)束后，應(yīng)該用初始流動相平衡色譜柱一段時間后，再進(jìn)行下一次實(shí)驗(yàn)。如果不能*平衡柱子，色譜圖中的早期譜峰的保留值和分離效果會發(fā)生改變。柱平衡一般需要5~10倍柱體積的初始流動相（如4.6×150mm的色譜柱為7~15ml）。然而，這一平衡體積也會隨流動相和樣品而異，需要試驗(yàn)人員對平衡體積進(jìn)行試驗(yàn)。